DOI：https://doi.org/10.1093/rb/rbac068

西南交通大学王进教授团队研究成果：

镁及其合金作为可吸收冠状动脉支架材料已被广泛研究。然而，镁基支架在血管内环境中的快速腐蚀率阻碍了其应用。为了赋予镁基支架适当的降解率和生物相容性，研究人员通过在纯镁上原位循环接枝 4,4′-二苯基甲烷二异氰酸酯和氨基丙基端聚二甲基硅氧烷，构建了疏水层。通过 SEM-EDS、X 射线光电子能谱和水接触角检测分析了层的化学成分。结果表明，表面引入了氨基，为后续改性提供了平台。改性表面的接触角值为 132.1°，表明表面具有亲水性。电化学测量和浸泡试验表明，疏水层显著提高了基底的抗腐蚀能力。此外，疏水性表面的生物相容性还通过血小板粘附、体外细胞相容性和体内皮下植入进行了检验。免疫学和组织学结果表明，疏水层具有良好的生物相容性。因此，本研究可能是一种很有前景的生物医学镁基支架表面改性方法。

一、 简介

心血管支架介入是治疗心血管狭窄最有效的方法。传统的心血管支架由惰性材料制成，如316L不锈钢、钴铬合金等。然而，永久植入血管内的支架会增加局部炎症反应、支架内再狭窄和晚期管腔损失的风险。因此，可吸收冠状动脉支架越来越受到人们的关注，这种支架可在组织修复后逐渐降解。镁基心血管支架由于具有良好的机械性能、生物降解性和生物相容性，已引起研究人员的极大关注。理想的可降解血管支架应在支撑时间和降解行为方面与血管重塑过程相匹配。血管重塑期一般为支架植入后的前6 个月。在此期间，支架应保持足够的机械支持，这是确保血管修复的重要机械条件。然后，支架以适当的速度逐渐降解，降解过程不会对周围组织造成不良反应，预计在 12-18个月内完全降解。然而，由于镁基支架在体液中降解速度过快，很难满足要求。快速降解会导致局部pH值升高，氢气富集，支撑力过早丧失，不利于组织修复。

因此，提高镁基支架的耐腐蚀性是亟待解决的重要问题。为了提高镁及其合金的耐腐蚀性，人们研究了许多表面改性方法，包括转化涂层、微弧氧化、电沉积、氟化物处理、离子注入和聚合物涂层等。

随着研究的深入，一些研究人员开始在镁上制造疏水涂层，以增强其耐腐蚀性，因为疏水表面可以阻止基体与腐蚀环境的密切接触。人们研究了多种方法来制备镁及其合金的疏水涂层，包括阳极氧化、微弧氧化、电沉积、电纺丝等。一般来说，设计疏水和超疏水表面需要具备两个关键要素：粗糙表面和用低表面能分子修饰粗糙表面。此外，疏水表面还能有效抵抗血小板粘附。因此，在镁基血管支架表面构建疏水层有望同时提高耐腐蚀性和表面生物功能化。

然而，在镁血管支架上构建疏水涂层的研究相对较少。大多数疏水性涂层的制备方法复杂，所含化学试剂对环境影响较小。同时，大多数疏水涂层的制备方法复杂，成本高昂，含有一些有害试剂或无法在复杂表面制备。此外，疏水层表面是否具有生物大分子的二次接枝能力也至关重要。如果疏水层表面具有特定的功能基团，如羧基、氨基等，则可以有效地接枝功能性生物分子，进一步赋予表面生物功能。

在这项研究中，首先用碱性处理纯镁，使其形成粗糙的微结构表面，然后在碱性预处理过的镁表面交替循环接枝 4,4′二苯基甲烷二异氰酸酯（MDI）和氨基丙基端聚二甲基硅氧烷（NH₂-PDMS-NH₂），以获得疏水层。MDI是一种有机硅。有机硅具有独特的材料特性，如疏水性、低表面能和良好的生物相容性，因此已被广泛应用于医学领域。PDMS 具有较强的疏水性和较低的表面张力，因此常用于构建疏水表面。此外，PDMS还因其良好的生物相容性被广泛用于制作细胞培养的微流控芯片。

疏水性表面可以阻止基底与腐蚀性环境的接触，从而有助于提高耐腐蚀性。此外，疏水层还具有良好的生物相容性，该层可为随后的生物大分子接枝提供氨基。我们对疏水层的耐腐蚀性和生物相容性进行了系统研究。

图1 通过在镁上循环接枝聚二甲基硅氧烷制备疏水层提高耐腐蚀性和生物相容性。

二、 表面表征

裸露的Mg基材、Mg-OH和Mg-OH-(M/P)的SEM图像如图2所示。裸露的Mg显示出相对均匀的表面，有微小的凹槽，这是抛光造成的。经过碱热处理后，Mg-OH的表面比Mg更光滑，这是由于表面形成了Mg(OH)₂。值得注意的是，在接枝MDI和NH₂-PDMS-NH₂之后，Mg-OH-(M/P)表面出现了微小的颗粒。这可能是由于分子表面接枝。表面化学性质需要进一步研究。

图2 Mg、Mg-OH和Mg-OH-(M/P)的表面形态。

利用扫描电子显微镜（SEM）和能量色散光谱仪（EDS）线扫描对涂层的横截面形貌和元素分布进行了分析，结果如图3所示。如图3a所示，Mg-OH和Mg-OH-(M/P)均未显示出明显的层-基体界面。这可能是因为氢氧化镁层是通过镁基体的连续氧化逐渐生长的。这也反映出涂层可能具有良好的附着力。通过图3b中横截面的元素分布，可以推断出涂层的厚度。Mg-OH和Mg-OH-(M/P)的Mg含量均从表面到基体逐渐增加；相比之下，C和O含量略有下降。此外，Mg-OH-(M/P)表面的C元素含量明显高于Mg-OH，这是由于表面上的疏水层所致。结果表明，Mg-OH和Mg-OH-(M/P)的表面层厚度分别为约1.9μm和2.4μm。但是，在Mg-OH-(M/P)的疏水层中未检测到N和Si元素，这可能是由于这两种元素在层中的含量较低。需要进一步进行材料表征。

图3 Mg-OH和Mg-OH-(M/P)的截面SEM图像（a）和EDS线分析（b）。

XPS可进一步测量样品表面元素的化学状态。如图4和表1所示，碱处理导致Mg-OH的O 1s峰增强。对于镁基底，O 1s的浓度（52.65%）表明自然氧化形成了氧化镁膜。碱处理后，O 1s浓度增加，Mg 1s浓度降低，这表明表面形成了新的氧化膜。MDI和PDMS循环接枝三次后，Mg-OH-(M/P)出现了N 1s和Si 2p峰，表明MDI和PDMS分子成功固定在了表面。

图4 (a)XPS宽扫描；(b)C1s高分辨率光谱；(c)Mg1s高分辨率光谱；(d)O 1s高分辨率光谱；(e)N1s高分辨率光谱；(f)Mg、Mg-OH和Mg-OH-(M/P)的Si 2p高分辨率光谱。

表1 不同样品的表面元素浓度

对O 1s峰配位进行了进一步研究（图5）。镁的O 1s峰可解析为531.9eV（镁羧酸盐）、531.2eV（Mg(OH)₂）和530.4eV（氧化镁）三个典型峰。碱处理后，Mg-OH的O 1s峰可被曲线拟合为531.2eV（Mg(OH)₂）和530.4eV（MgO），表明新形成的氧化层。MDI和PDMS接枝后，O 1s峰可拟合为四个典型峰，分别为532.6eV（PDMS中的Si-O-Si）、531.6eV（MDI中的C=O）、531.2eV（Mg(OH)₂）和530.4eV（MgO）。考虑到上述结果，我们可以得出结论：MDI和PDMS成功地固定在了表面。

图5 (a)Mg、(b)Mg-OH和(c)Mg-OH-(M/P)的XPS高分辨率O 1s曲线拟合结果。

Mg-OH-(M/P)上的胺基团可用于固定生物大分子，从而进一步提高生物相容性。因此，用AOII比色法检测了样品表面胺基团的密度，如图6所示。Mg-OH-(M/P)的最大值为∼8.03nmol/cm²。在Mg和Mg-OH上检测到的胺密度分别为0.08和0.1nmol/cm²。这是由于酸性橙被Mg和Mg-OH表面的氧化层物理吸附所致。Mg-OH-(M/P)上的胺基团可用于接枝生物大分子以进一步改性。

图6 Mg、Mg-OH和Mg-OH-（M/P）表面的-NH2密度。

三、表面润湿性

镁涂层的润湿性对耐腐蚀性非常重要。最近的研究表明，在镁合金上构建疏水表面是增强其耐腐蚀性的有效方法。疏水表面具有阻碍表面与腐蚀环境密切接触的能力。测量Mg、Mg-OH和Mg-OH-（M/P）的水接触角是为了研究其表面润湿性。如图7所示，裸镁表面的水接触角约为78.5°，而Mg-OH的水接触角则明显下降到36.7°。Mg-OH表面有大量的-OH基团，这些基团是通过碱处理引入的。值得注意的是，MDI和PDMS循环接枝后，Mg-OH-（M/P）的接触天使值为132.1°，表明其表面具有亲水性。这种亲水表面的耐腐蚀性有待进一步研究。

图7 Mg,Mg-OH和Mg-OH-(M/P).水接触角的变化。

四、电化学腐蚀行为

所有样品的腐蚀性能首先由PDP曲线表征，如图8a所示。表2列出了用Tafel法测定的相应腐蚀电位和电流值。与镁相比，Mg-OH和Mg-OH-（M/P）的腐蚀电位出现了明显的正移。碱加热处理后，纯镁表面形成了Mg(OH)₂的被动层，从而提高了耐腐蚀性。此外，Mg-OH-(M/P)的电流密度值是所有样品中最低的，比裸镁低约两个数量级，这表明疏水表面能有效提高基体的耐腐蚀性。图8b显示了样品在PBS中的奈奎斯特图，与镁和Mg-OH相比，Mg-OH-(M/P)的阻抗明显更大，这表明其具有更高的耐腐蚀性。

图8 (a)Mg、Mg-OH和Mg-OH-(M/P)的PDP分析(b)Mg、Mg-OH和Mg-OH-(M/P)的EIS光谱。

表2 在37 ± 0.5°C的PBS溶液中，样品的腐蚀电位（Ecorr）、腐蚀电流密度（icorr）和腐蚀速率（Pi）

五、浸泡降解

根据镁的腐蚀反应Mg+2H₂O→Mg₂++2OH-+H₂，溶液的氢气生成和pH值升高间接反映了腐蚀速率。在37°C的PBS中，检测了Mg、Mg-OH和Mg-OH-(M/P)的氢气生成（图9a）和pH值（图9b）与浸泡时间的函数关系。浸泡15天后的扫描电镜图像也显示在图9c中。镁释放的H₂量最大，为17ml cm^-2，释放速度最快。Mg-OH在浸泡过程中释放了15ml cm^-2 H₂，由于Mg-OH上有氧化层，其释放速率在早期低于Mg。但氧化层的化学性质不稳定，氧化层破坏后腐蚀速度加快。与Mg和Mg-OH相比，Mg-OH-（M/P）的H₂蒸发量（∼7ml cm^-2）明显较低，H₂蒸发率也较低。这可能是由于疏水层减少了基底与腐蚀环境的接触面积。在pH值变化方面也观察到类似的趋势。与Mg和Mg-OH相比，Mg-OH-(M/P)的pH值上升幅度最小。浸泡15天后的扫描电镜图像进一步显示，Mg-OH-(M/P)保持了相对平滑和完整的覆盖，而Mg和Mg-OH则经历了更严重的腐蚀，出现了网状裂纹。

图9 在37 ± 0.5°C的PBS溶液中浸泡15天后的样品浸入降解结果：(a)氢气生成；(b)pH值；(c)浸泡后的SEM图像。

六、血液相容性

研究表明，白蛋白固定在材料表面可赋予其抗凝血功能。因此，研究白蛋白在样品表面的吸附能力可以反映样品的抗凝能力。为了测定白蛋白在样品表面的吸附能力，我们使用micro-BCA蛋白检测试剂盒检测BSA。如图10a所示，Mg-OH-(M/P)吸附了最多的白蛋白（0.76mg/cm²）。由于氧化作用，镁样品上形成了少量的Mg(OH)₂和MgO，显示出对蛋白质的吸附作用（0.42mg/cm²）。Mg-OH上形成的氧化层疏松多孔，比Mg更容易吸附水和蛋白质，因此对BSA的吸附量更大，为0.57mg/cm²。由于Mg-OH-(M/P)具有很强的疏水性，其表面容易与蛋白质发生不可逆吸附，因此Mg-OH-(M/P)吸附的BSA量最大。

图10 Mg、Mg-OH和Mg-OH-(M/P)的(a)BSA吸附量和(b)溶血率。

由于血液相容性对于与血液接触的材料至关重要，因此进行了溶血率和血小板粘附测定。通常，溶血率低于5%是可以接受的。图10b显示了样品的溶血率。裸镁的溶血率最高（约57%）。这可能是由于裸镁的快速降解速率，导致局部环境中的渗透压和pH值过高，导致血红蛋白破裂，最终导致高溶血率。Mg-OH的溶血率明显下降，碱处理形成的Mg(OH)₂层在一定程度上抑制了基底的腐蚀。然而，Mg-OH的溶血率仍远高于安全水平。在涂覆疏水层后，Mg-OH-(M/P)的溶血率降至2.03%，这是由于耐腐蚀性的提高。

图11显示了粘附在样品上的血小板的荧光显微镜和扫描电子显微镜（SEM）图像。根据荧光图像，Mg-OH-(M/P)表面粘附的血小板最少。Mg-OH表面粘附的血小板数量多于Mg-OH-(M/P)表面，但少于Mg表面。当镁被腐蚀时，表面会出现腐蚀产物，很难将血小板与腐蚀产物区分开来。从SEM图像中可以观察到样品上血小板的形状。与Mg-OH相比，粘附在Mg-OH-(M/P)上的血小板显示出较少的伪足或激活。结果表明，在这些样品中，具有超疏水表面的Mg-OH-(M/P)表现出最佳的血液相容性。

图11 荧光显微镜和扫描电镜图像Mg、Mg-OH和Mg-OH-(M/P)样品表面附着的血小板的扫描电镜图像。

七、EC和SMC的细胞相容性

由于血管细胞的细胞相容性是血管支架的重要评估指标，本研究对与样品共培养的EC和SMC的生长行为进行了分析。图12和图13总结了与样品共培养2小时和1天后培养板上的EC和SMC细胞粘附情况。为了获得细胞密度和形态，用罗丹明染色细胞细胞骨架，并用荧光显微镜检测。图12a和b显示了与样品间接接触1天的心肌细胞的数量和存活率。孵育1天后，间接接触Mg-OH-(M/P)的细胞数明显多于Mg-OH和Mg。而Mg-OH-(M/P)周围的存活率明显高于Mg和Mg-OH。与样品共培养2小时和1天的EC的荧光显微镜图见图12c。与Mg-OH-(M/P)间接接触生长的EC在1天后呈现出特有的鹅卵石形状。相比之下，与镁和Mg-OH间接接触的细胞出现了收缩。与其他样品相比，Mg-OH-(M/P)上的疏水层具有更好的耐腐蚀性，氢气生成和pH值升高的情况也较少，因此EC的细胞相容性更好。

图12 (a)平板上心肌细胞的统计计数；(b)用细胞计数试剂盒-8（CCK8）分析的细胞存活率；(c)与样品共培养2小时和1天后，粘附在平板上的心肌细胞的代表性荧光图像。

图13 (a)平板上SMC的统计计数；(b)用细胞计数试剂盒-8（CCK8）分析的细胞活力；(c)与样品共培养2小时和1天后平板上粘附的SMC的代表性荧光图像。

与样品共培养的SMC表现出与EC相似的生长行为。图13a显示了与样品共培养1天后附着的SMC数量。由于镁的降解速度相对较快，因此其附着的SMC数量最少。培养1天后，Mg-OH-(M/P)的细胞密度（510±132个细胞/平方毫米）明显高于Mg（278±49个细胞/平方毫米）和Mg-OH（411±16个细胞/平方毫米）。用CCK8分析的SMC能力结果见图13b。Mg-OH-(M/P)和Mg之间存在明显差异，其结果与细胞密度相对应。根据图13c中的荧光图像，在Mg周围培养的SMC呈不自然的圆形，没有伸长。在Mg-OH-(M/P)周围培养的SMC比在Mg和Mg-OH周围培养2小时和1天的SMC更加平展和伸长。Mg-OH-(M/P)层降低了裸镁的腐蚀速率，从而改善了SMC的生长状态。由于改性样品没有接枝抑制SMC的生物大分子，因此Mg-OH-(M/P)周围的SMC没有受到抑制。然而，Mg-OH-(M/P)上的胺基团可用于接枝相关的生物大分子以抑制平滑肌的生长。

八、皮下注射

通过对大鼠进行为期30天的皮下注射，评估了样品在体内的降解行为以及组织对样品的反应，见图14。图14a显示了样品周围纤维囊的形态，很明显，镁周围的纤维囊充满了氢气，这表明腐蚀速度最快。植入样品的腐蚀形态如图14b所示，与Mg-OH-(M/P)相比，未经处理的Mg和Mg-OH的降解更为严重，出现了腐蚀坑。图14c描述了Mg、Mg-OH和Mg-OH-(M/P)在植入30天后的质量损失。与未经处理的镁和Mg-OH相比，植入30天后Mg-OH-(M/P)的质量损失明显降低。上述结果表明，与未经处理的镁相比，Mg-OH-(M/P)具有更好的耐腐蚀性。

图14 (a)纤维囊，(b)腐蚀形态，(c)皮下植入30天后样本的重量损失。

图15 30天后样本周围皮下组织的HE染色（M代表植入部位）。

图15显示了组织对植入物反应的组织学评估。植入物周围纤维包膜的厚度代表了植入物的组织炎症程度。在皮下植入30天后，观察到镁周围有很厚的纤维包囊（199±27μm）。Mg-OH可减轻纤维囊的形成（153±36μm），表明炎症反应较轻。对于Mg-OH-(M/P)，由于耐腐蚀性能提高，界面上形成的肉芽更少，纤维囊更薄（118±21μm）。红圈标注区域代表毛细血管，表明样品周围的炎症反应正在发展。与其他样品相比，Mg-OH-(M/P)周围的毛细血管较小，也不太密集。结果表明，Mg-OH-(M/P)可以减轻植入部位周围的组织反应。

九、结论

本研究通过在纯镁上循环接枝MDI和NH₂-PDMS-NH₂制备了疏水分子层。疏水层能有效提高基底的耐腐蚀性。由于接枝MDI和NH₂-PDMS-NH₂的疏水基团，水在涂层表面的静态接触角为132.1°。在PBS中浸泡210小时后，疏水性表面可明显减缓镁的降解速率。与裸镁相比，Mg-OH-(M/P)具有更好的耐腐蚀性，从而使EC和SMC具有更好的细胞相容性。此外，涂层样品提高了体内的耐腐蚀性，减轻了植入物周围的组织反应。此外，疏水层含有丰富的官能团，可用于生物分子的后续修饰。这种疏水层具有在生物医学镁支架表面构建多功能改性平台的巨大潜力。

通讯作者

王进，教授，博士生导师，1999年毕业于四川大学，获得材料学博士学位。先后主持国家重点研发项目课题1项，子课题1项、国家自然科学基金项目3项、教育部新世纪优秀人才项目1项、四川省国际合作项目1项，作为主研人员参与国家自然科学基金重点项目1项， “973”项目2项和 “863”项目2项。研究工作以解决心血管材料及植介入器械的凝血、组织增生、内皮延迟愈合和生物材料体内植入感染等问题为出发点，创新性地发展了多种表面改性技术构建了具有抗凝血、抑制平滑肌细胞增殖、诱导内皮化、抗炎症和抗细菌粘附的生物医用材料及器械，并对相应的机理进行了较为深入的研究，获得的研究结果发表于Biomaterials、Advanced Healthcare Materials、ACS Applied Materials & Interfaces。还将研究成果应用于药物洗脱支架的研制，作为核心人员参与研发的海利欧斯药物洗脱支架已获得国家食品药品监督管理局的准产批准，目前已经临床应用20万套。2007年入选教育部新世纪优秀人才计划，2013年入选四川省有突出贡献的优秀专家。2016年获教育部技术发明奖二等奖（排名第三），2007年获四川省科技进步一等奖（排名第五），2015年获中国生物医学工程学会黄家驷生物医学工程奖二等奖（排名第三）。以第一和通讯作者发表文章80篇，其中SCI检索65篇，获得授权中国发明专利22项。作为核心人员参与研发的“可降解镁合金冠脉支架技术”于2019年4月成功实现了技术转让。